单细胞分辨率解析组织原位信息，mIHC帮您轻松实现

什么是mIHC技术?

mIHC（Multiplex immunohistochemistry，多重免疫组化）是一项基于酪胺信号放大的多重抗体荧光标记技术，可以在细胞或组织样本原位上检测多个目标靶点，通过这些靶点的组合和位置关系的研究，进而阐明其相互作用的机理。

 

mIHC的技术优势

目前，多种研究手段在刻画肿瘤微环境中发挥作用:

流式细胞术能够筛选分析多种细胞型组分，却无法得知细胞的形态与空间位置信息；

免疫组化能够直观标记某个蛋白的分布与表达，然而标记数量有限；通过连续切片技术虽然可实现多标，但是存在一定的误差，非真正意义上的单细胞多标;

 

多重免疫组化（mIHC）技术在肿瘤微环境分析中具有独特优势，能够突破常规免疫荧光抗体种属限制，可实现在一张切片实现多个靶标的标记，并能对细胞的表型，细胞间的原位空间信息，肿瘤微环境的生态群进行精准定量分析。

芯超mIHC使用的技术平台及技术原理

mIHC技术流程

01

TSA技术组织多重染色

使用多重荧光免疫组化染色试剂盒，在石蜡包埋的组织切片上对切片进行TSA酪胺信号放大技术，采用HRP标记的二抗，HRP催化加入体系的荧光素底物，生成活化荧光底物，活化底物可与抗原上的酪氨酸共价结合，使样品上稳定地共价结合荧光素。之后用热修复洗去非共价结合的抗体，避免交叉反应，如此往复实现多重荧光标记。

TSA酪胺信号放大技术

02

全景连续光谱扫描

使用TissueFAXS Spectra系统进行连续全光谱高倍率成像，该显微镜通过全发射光谱，每10nm记录一次图像，这将允许7种不同的荧光团同时捕获到一张合成图像中（A），然后可以将其光谱进行拆分成6个独立的图像，每个图像代表一个荧光团（C-H）和核染色DAPI （B）。

芯超 - 全景连续光谱扫描及光谱拆分

03

单细胞表型量化分析

将TissueFAXS获取的图像导入StrataQuest定量分析系统对图像进行单细胞分辨率数据分析。

3.1 细胞核识别

通过DAPI核染色进行细胞识别，可以准确区分每个细胞的细胞核、细胞质和细胞膜，同时根据细胞核荧光强度（纵坐标）与面积（横坐标）作图，设门圈选有效细胞核（红色标记），确保仅测量细胞，排除细胞碎片。

芯超 - 细胞识别

3.2  抗体信号识别

以抗体Foxp3荧光信号识别分析为例描述信号识别过程：抗体Foxp3单通道信号，抗体Foxp3（黄色）+ DAPI(蓝色）；以有效细胞核为核心，根据抗体Foxp3染色情况设定距离半径，寻找细胞核中的蛋白荧光信号；以抗体Foxp3荧光强度（纵坐标）与面积（横坐标）作图，设阈值划分出阳性细胞（红色标记），UR行数据为Foxp3抗体信号阳性细胞数量及百分比。

芯超 - 抗体信号识别图

3.3 双抗共表达细胞识别

抗体PDL1抗体panCK双阳性细胞识别为例。以有效单细胞为基础，抗体F（PD-L1,绿色）荧光强度（横坐标）抗体A（panCK, 紫色）荧光强度（纵坐标）作图，得到PDL1+CK+细胞。

芯超 - 双荧光信号细胞识别

3.4 组织拆分

以上皮来源肿瘤为例，以CK阳性信号识别拆分以分离基质和上皮肿瘤组织区域。

芯超 - 组织拆分图

04

空间结构量化分析

利用TissueFAXS Cytometry技术实现从单细胞、细胞群、组织结构及至器官级别的多模态，跨尺度的空间关系量化分析研究。

比如可在研究肿瘤微环境方向通过空间数据挖掘延伸至肿瘤亚微环境，进一步细化对肿瘤亚微环境中多种标记细胞与单细胞或细胞群体之间、单细胞与肿瘤组织之间、特定细胞群体与肿瘤组织之间，肿瘤组织与血管之间等复杂的相互作用关系，进而衍生出更为丰富社会学关系，挖掘以细胞社区为功能单位的科学信息，为解释疾病的发生发展提供重要的数据来源。

芯超 - 空间结构量化分析

以上就是芯超完整的mIHC实验流程，看完这些，您是不是对多重免疫组化有了初步的了解？同时各位老师可能也有了更多的疑问，比如以下这些：

• mIHC可以应用于哪些场景？我该如何将mIHC应用于我的课题中？

• 我想做多重免疫组化来研究肿瘤免疫微环境，我该怎么去找目标细胞类型对应的marker?

• 选好了多重免疫组化的marker，我该怎么挑选适用于mIHC实验的抗体？

• 我想同时标记超过10种蛋白，可以实现吗？有什么好的解决方案？

• 得到了多个靶标在组织中的分布和定量情况，我该如何进行分析，才能将这些实验数据转化成有意义的研究成果？

 

不要着急，您的疑问芯超会一一为您解答，欢迎关注本公众号，之后的几期，小编会围绕以上这些问题再后面几期分别展开叙述，敬请期待！